ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ T-SPOT.TB

Добрый день. Собираюсь сыну (8,5 лет) сделать т-спот. Рост 136, вес 28,5 (мы с мужем оба высокие и худые). Контакта с туббольным (известном мне) – не было, живем втроем, в хороших условиях, периодически сын ходит к бабушке, все обследованы. В сад не ходил, посещает школу и спортивную школу. Все лето проводит в глухой деревне. По магазинам, автобусам и прочим людным местам не таскаем его. Ребенок болеет не сказать, что часто, но и не отличается богатырским здоровьем, аппетит под настроение. Из серьезных заболеваний: атипический дерматит (с продолжительными ремиссиями, в младенчестве было очень плохо с кожей), аллергия на ряд продуктов (куриный белок и другое), инфекционный мононуклеоз в 3 года (после которого ребенок потеет по ночам первые два часа после засыпания (плечи и шея). Относительно потливости заметили, что если перед сном бесится меньше обычного или если поужинал пораньше – то потливость меньше). Остальное стандартно: сопли-кашель по сезону. Бцж-м в роддоме сделали, рубчик фтизиатр где-то там видит, я не вижу.
Манту фев 2011 (1г 6 мес) – 6 мм
авг 2013 (4г 1 мес) – 7 мм
Перед школой и в первом классе были сделаны рентгены (один раз – как альтернатива манту, второй раз – при подозрении на пневмонию) без патологий. Но рентген делать больше не хочется, манту и диаскин – опасаюсь (сама все детство проходила с огромной краснотой из-за манту). В связи с этим вопрос:
1.Какова вероятность, что ребенок в этом возрасте и при такой социальной активности может быть инфицирован?
2.Если он инфицирован, то т-спот покажет положительный результат?
3.Если т-спот окажется положительным, то он всю оставшуюся жизнь будет положительным и сдавать его в дальнейшем уже бессмысленно, так?
4.Как будут разворачиваться события дальше: я обязана буду пойти к фтизиатру и что он предложит? Согласно инструкциям, какие будут обследования: сразу КТ, манту и диаскин вместе, или только рентген и флю родителей или только диаскин? Как дальше все это будет выглядеть? В какой последовательности должны будут назначаться обследования? Как их минимизировать? В каких случаях будут назначены профилактический или основной курс лечения?
Просто получается, что мы можем (при простом инфицировании, т.е. (как я понимаю,поправьте, если я не права) при отсутствии серьезной проблемы – большинство же из нас инфицированы) получить полный комплект обследований и назначений лекарств, или нет? Есть смысл рискнуть и сделать т-спот? Собираемся идти сдавать в конце месяца. Спасибо.

Отличие от других тестов

В чём разница между Т-Спот и другими методами обнаружения туберкулёза?

От внутрикожных проб — Манту и более современной его разновидности — Диаскинтеста, он отличается в следующем:

  • проводится вне организма человека;
  • имеет меньше ложноположительных реакций;
  • исключаются факторы воздействия на место укола (намочить, расчесать);
  • не зависит от аллергических реакций;
  • меньше человеческого фактора, ведь при внутрикожных тестах требуется правильно ввести препарат, замерить пуговку линейкой.

Манту (введение туберкулина) часто выдаёт ложноположительные реакции у детей, вакцинированных БЦЖ. «Диаскинтест» не туберкулиновый, поэтому ложных результатов из-за ранее сделанной прививки против туберкулёза не даёт.

На результаты Т-Спот не влияет вакцинация БЦЖ. Его можно делать сразу после этой прививки, тогда как для проведения внутрикожных тестов требуется подождать месяц.

Что лучше — «Диаскинтест» или Т-Спот? Эти методы исследования нельзя назвать равнозначными. Однако следует учитывать, что чувствительность Т-Спот по сравнению с Диаскинтестом ниже — 90% против 98%.

Можно ли проводить одновременно Т-Спот и «Диаскинтест»? Да, но нецелесообразно. И тот и другой метод нацелен на выявление инфицирования организма микобактериями туберкулёза.

Что лучше — квантифероновый тест или Т-Спот? Можно сказать, что Т-Спот, или интерфероновый тест — это английский аналог квантиферонового исследования. Суть обоих методов одинакова, различаются лишь способы определения реакции t-лимфоцитов на раздражение. Квантифероновый тест выявляет количество интерферона, а Т-Спот — клеток, которые его вырабатывают. Более трудоёмким является квантифероновый тест, возможно, поэтому лаборатории больше отдают предпочтение Т-Спот. По чувствительности и достоверности эти методы равнозначны, стоимость и сроки их выполнения также примерно одинаковы.

Что касается ПЦР диагностики туберкулёза — она чаще всего проводится для выявления внелёгочных форм болезни или когда другие методы недоступны. Исследование мокроты целесообразно проводить, если есть кашель, а забор мазка при бронхоскопии — более инвазивное вмешательство по сравнению со сдачей крови.

Добрый день!
Не знаю даже кому правильнее задавать вопрос: иммунологу или фтизиатру.Итак: мальчик, 8 лет, физ.развитие выше среднего: рост-148, вес 47 кг(полненький), физ.активность и успеваемость в школе хорошие,жизнерадостный нормальный мальчишка,аппетит отменный. Болеет простудными и проч. заболеваниями редко:раз-два в год и обычно это просто насморк и незначительное повышение температуры. Из проблем есть несильно выраженный атопический дерматит,укусы комаров и проч. насекомх сильно разувает,но проходит за пару дней,без осложнений.
С раннего возраста у него были гиперэргические реакции на р-манту. Начиная с 3х лет, это 14-15 мм, с отеком в полруки. Но до сих пор нас к фтизиатру не отправляли. В семье все регулярно проходят мед.осмотры,туберкулеза у родных/знакомых не выявлялось. В этом году впервые (апрель 2017) сделали Диаскинтест, результат та же гиперэргическая реакция, папула 17 мм.Отправили к фтизиатру, сданы все назначенные анализы — кровь и моча в норме, КТ абсолютно чистые, УЗИ всех органов — идеально. Сделали в тубдиспансере Р-манту и диаскинтест одновременно, перед этим по совету фтизиатра несколько дней пили Зиртек. К вечеру ребенок затемпературил(37.2), жаловался на головную боль, сухость во рту и на следующий день был вялый, руки(обе) распухли до плеча, рука с Диаскинтестом покрылась пузырями. По оценке фтизиатра т-манту 15мм, Диаскинтетс — 36мм). Параллельно делали анализы на оппортунист.инфекции, выявился высокий титр антител(как пояснил иммунолог уже не опасный) цитомегаловируса и высокий катионный белок. Решили для уточнения результата Диаскинтеста сделать Т-spot на туберкулез, сдали анализ 26.07 -результат сомнительный,т.к. высокая спонтанная выработка гамма-интерферонов,рекомендовано пересдать через 2-4 недели. Пересдали 18.07 — результат опять сомнительный. Пишут T-SPOT.TB- неопределнный, т-спот антигены А(ESAT-6) и B(ECFP-10) не обнаружены.Рекомендована консультация иммунолога,т.к. анализ «недостоверен в связи с высокой спонтанной продукцией ИФН-?» требуется исследование иммунного статуса,чтобы исключить причины высокой спонтанной продукции этого гамма-интерферона. От чего может быть эта высокая спонтанная продукция? все эти месяцы перемеряю периодически температуру ребенку — все нормально, аппетит богатырский, ничего не болит,настроение хорошее.Никаких препаратов,витаминов не принимает..Только мама сон потеряла..Может уже правда,пора туберкулез лечить?

Подготовка к анализу

Особых требований для сдачи образца не существует. Откуда берут кровь для Т-Спот? — проводят обычный забор из вены:

  • у малышей до 2 лет — 2 мл;
  • у детей 2–9 лет — 4 мл;
  • у взрослых и подростков старше 10 лет — 8 мл.

Кровь для Т-Спот сдаётся натощак. Как минимум нельзя есть за 3–4 часа до анализа. Но лучше делать тест с утра.

Нежелательно употреблять алкоголь и курить в течение суток до сдачи анализа. При длительном приёме каких-либо препаратов необходима консультация врача.

Анализ крови

Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT® ТВ)

Набор реагентов для in vitro диагностики туберкулезной инфекции

Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) является тестом для in vitro диагностики туберкулеза путем выявления эффекторных Т клеток, реагирующих на стимуляцию антигеном Mycobacterium tuberculosis, предназначенным в качестве дополнительного средства диагностики туберкулезной инфекции.

Введение

Иммунный ответ на инфицирование М. tuberculosis является преимущественно клеточно-опосредованным. В процессе этого ответа, Т клетки сенсибилизируются к антигенам М. tuberculosis. Активированные эффекторные Т клетки, CD4 и CD8, выделенные из крови, могут быть подсчитаны благодаря способности стимулироваться этими антигенами in vitro 1,2. Применение специально подобранных антигенов ESAT-6 и CFP10, входящих в состав микобактерий комплекса М. tuberculosis (М tuberculosis, М bovis, М africanum), повышает эффективность и специфичность теста, так как эти антигены отсутствуют в БЦЖ и во многих других не вирулентных для человека микобактериях, находящихся в окружающей среде3,4

Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®. ТВ) является упрощенным вариантом иммуноферментного метода ELISPOT, в котором цитокины связываются буквально рядом с секретирующими их клетками, до растворения в супернатанте и до захвата рецепторами соседних клеток или разрушения. Поэтому анализ ELISPOT значительно более чувствителен, чем традиционно применяемый метод ИФА 5. Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT®.TB) предназначен для выявления эффекторных Т клеток, которые отвечают на стимуляцию специфическим антигеном М. tuberculosis3,4,6’9, и позволяет подсчитать отдельные активированные ТБ-специфичные Т клетки. Данный анализ может быть применен для всех пациентов, находящихся в группе риска по латентной туберкулезной инфекции, а также для лиц с подозрением на туберкулез10,11 вне зависимости от их возраста, пола, иммунного статуса, терапии.

Литературные и клинические данные

Путем исследования 93 образцов от доноров с установленным по истории болезни и личной информации низким риском инфицирования М tuberculosis оценивали специфичность. Рассчитанная специфичность T-SPOT.ТB (93 отрицательных из 93) составила 100% (95%

доверительные интервалы 95.8% — 100%).

Путем исследования 87 образцов культурально подтвержденных случаев заражения М. tuberculosis, включая группы с иммунной недостаточностью оценивали чувствительность. Рассчитанная чувствительность T-SPOT.ТВ (86 положительных из 87) составляет 98.8% (95% доверительные интервалы 90.8% — 99.9%).

Исследования в РФ в группе детей от 6 до 14 лет:

Специфичность оценивалась путем исследования 15 образцов у здоровых туберкулинотрицательных детей. Специфичность теста составила 100 %.

Чувствительность оценивалась при исследовании 15 образцов у пациентов, страдающих туберкулезом легких. Чувствительность теста составила 93,3 %.

Принцип исследования

Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяют из образцов цельной крови и промывают, с целью удаления любых источников фонового сигнала, мешающего учету. Затем МНПК подсчитывают с тем, чтобы в анализируемый образец добавить стандартное количество клеток. Подсчет служит гарантией того, что даже для анализа образцов крови лиц с низкими содержанием Т клеток вследствие ослабления иммунной системы (иммунная недостаточность и иммуносупрессия) в лунки планшета будет добавлено соответсвующее количество клеток. Стадии промывания и подсчета клеток обеспечивают наилучшие условия для выявления больных и инфицированных туберкулезной инфекцией.

Краткая схема тестирования представлена на рис. 1:

МНПК инкубируют с антигеном для стимуляции имеющихся сенсибилизированных Т клеток. Секретированные этими клетками цитокины связываются и удерживаются специфическими антителами, находящимися на поверхности мембраны, выстилающей лунку, остальные клетки удаляются при промывании. Затем специфические антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой и нацеленные на различные эпитопы молекулы цитокина, добавляются для связывания с цитокином, удерживаемым на поверхности мембраны планшета. Несвязанный конъюгат удаляется при промывании. В каждую лунку добавляется раствор субстрата; он расщепляется связанным ферментом и образует пятно нерастворимого преципитата в месте реакции. Каждое пятно является отпечатком одной интерферон гамма-секретирующей Т клетки, а оценка количества полученных пятен является количественной характеристикой содержания сенсибилизированных микобактериями туберкулеза эффекторных Т клеток в периферической крови.

Состав набора реагентов

  1. Микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к цитокину — интеферону гамма человека (IFN-y);
  2. Антиген А: антиген ESAT-6, бычий сывороточный альбумин (БСА), антимикробные средства;
  3. Антиген В: антиген CFP10, БСА, антимикробные средства;
  4. Положительный контрольный образец (положительный контроль): фитогемагглютинин (ФГА) для контроля функциональных свойств клеток 15 мкг/мл, БСА, антимикробные средства;
  5. Конъюгированный реагент (коньюгат): мышиные моноклональные антитела к цитокину IFN-y, конъюгированные со щелочной фосфатазой;
  6. Раствор субстрата: раствор BCIP/NBTplus (BCIP: 5-Бромо-4-хлоро-3- индол-фосфат, NBT: нитро-тетразолиум синий).

Ограничения

Набор предназначен:

  • Только для диагностики in vitro.
  • Только для профессионального применения.
  • Закрытый набор реагентов следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. После истечения срока годности, обозначенного на этикетке, набор не пригоден для дальнейшего использования.
  • Вскрытый набор реагентов допускается хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 8 недель после вскрытия, но не более срока годности набора.
  • Запрещается смешивать компоненты из разных наборов.
  • Перед использованием необходимо внимательно прочитать приложенную инструкцию.
  • Следует соблюдать правила препятствующие загрязнению реагентов, лунок планшета, клеточных суспензий и клеточной среды.
  • Следует избегать изменений рекомендованной техники пипетирования и отмывки, времени инкубации и/или температуры, т.к. они могут повлиять на полученные результаты.
  • Кровь у обследуемого лица должна забираться не более, чем за 8 ч до начала исследования.
  • Хранение и транспортирование образцов крови в лабораторию производится при температуре от 18 до 25 °С. Образцы цельной крови нельзя ни охлаждать, ни замораживать.
  • Т-СПОТ.ТБ (Т-SPOT®.ТВ) следует применять и интерпретировать только совместно с общей клинической картиной.
  • Негативный результат теста не исключает возможности инфицирования М. tuberculosis.
  • Антигены ESAT-6 и CFP10 отсутствуют в штаммах БЦЖ и у большинства микобактерий, циркулирующих в окружающей среде, за исключением М kansasii, М szulgai и М. marinum3,4 и М. gordonae.

Предупреждения и меры предосторожности

При работе с материалом, полученным от людей, необходимо соблюдать меры предосторожности. Все образцы крови должны считаться потенциально инфицированными.

Работа с образцами крови и компонентами исследования, их использование, хранение и уничтожение должны производиться в соответствии с процедурами, описанными в соответствующих Санитарно-эпидемиологических правилах, как СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и др.

Следует соблюдать осторожность при работе с химическими реактивами. Все реактивы должны считаться потенциально опасными.

Необходимые материалы и оборудование, которые не входят в набор:

  1. Пробирки для забора крови (Vacutainer® СРТ™ , фирма Бектон Дикинсон кат. № 368886) или «пробирки с цитратом» (SARSTEDT Aktiengesellschaft & Co., кат № 32.525.326) или аналогичные пробирки, готовые к использованию, например, стандартный литий-гепариновые пробирки. Не допускается использование пробирки с ЭДТА.
  2. Среда для выделения мононуклеаров периферической крови (МНПК) (Фиколл или Lymphosep Lymphozyte Separation media cat # L0560-100, фирма Biowest).
  3. Центрифуга, обеспечивающая не менее 300g, например, Allegra™ 6 Centrifuga, фирма BECKMAN или аналогичная,
  4. Автоматизированный гематологический анализатор для диагностического тестирования цельной крови in vitro (COBAS MICROS ОТ, фирма Roche Diagnostic Systems/ABX Hematology, или аналогичный) либо счетные камеры Гаряева или Нойбауера.
  5. Инкубатор с влажной камерой, в которой поддерживается температура (37±1) °С и 5 % атмосфера С02 (СО2 Water-Jacketed Incubator, фирмы NUAIRE™ US AUTOFLOW или аналогичный).
  6. Пипетки полуавтоматические одноканальные и многоканальные переменного объема со стерильными одноразовыми наконечниками.
  7. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) (GIBCO™ фирма Инвитроген кат № 14040-091) или аналогичный.
  8. Дистиллированная вода.
  9. Микроскоп или увеличительное стекло для подсчета спотов (пятен).
  10. Питательные среды:

Питательная среда RPMI-1640 для культур клеток в комплекте с JI- глутамамином, например, GIBCO™ (фирма Инвитроген кат № 21875-034) или ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН», ТУ 9385-014-01895045-2007. Хранят при температуре от 2 до 8 °С.

Бессывороточная питательная среда AIM-V™, например, GIBCO™ (фирма Инвитроген кат № 31035-025), или «Питательная среда 199» ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН» ТУ 9385-009-01895045-2007. Хранят при температуре от 2 до 8 °С.

Бессывороточную питательную среду рекомендуется предварительно разлить в условиях асептики в отдельные флаконы вместимостью 50 мл. На все флаконы наклеивают этикетки на которых указывают: дату розлива, срок годности, название среды, номер серии. Хранят при температуре от 2 до 8 °С.

Перед использованием флакон с питательной средой выдерживают в термостате при 37 °С в течение 10 мин.

Подготовка реагентов

  1. Микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к цитокину — интеферону гамма человека (IFN-y) — поставляется готовым к употреблению. Извлекают необходимое количество 8-луночных стрипов и оставляют согреться до комнатной температуры. Оставшиеся стрипы упаковывают в наружную упаковку из фольги вместе с имеющимся в ней осушителем и помещают в холодильник.
  2. Антиген М tuberculosis ESAT-6 (антиген А) готов к употреблению.
  3. Антиген М. tuberculosis CFP10 (антиген В) готов к употреблению.
  4. Положительный контрольный образец готов к употреблению.
  5. Непосредственно перед началом анализа готовят рабочий раствор конъюгированного реагента 1:200. Для этого рассчитывают требуемый объем рабочего раствора конъюгированного реагента.
  6. Раствор субстрата поставляется готовым к употреблению. Не менее чем за 30 мин до начала контроля раствор субстрата доводят до температуры от 15 до 25 °С.

Методика проведения исследования

Исследование должно проводиться в соответствии с принципами Надлежащей лабораторной практики (GLP) и в строгом соответствии с данной инструкцией по применению.

Компания «Оксфорд Иммунотек Лтд» подготовила ряд технических документов, в которых описываются возможные дополнительные варианты забора крови и подготовки образцов, выбора питательной среды и методов подсчета пятен, апробированные в лаборатории фирмы-производителя. В дополнение к основным пунктам и примечаниям в данной инструкции по применению на электронном носителе на русском и английском языках также записаны: техническое руководство, визуальное руководство, калькуляторы для расчета скорости центрифуги, разведения клеток и раствора субстрата.

Забор крови и подготовка образцов

Необходимо контролировать правильность процедуры сбора МНПК, подсчета МНПК и выбор подходящей среды для поддержания функциональных свойств Т клеток на этапе первичной инкубации. Обычно, для имункомпетентного пациента, достаточное для проведения исследования количество МНПК может быть получено из образца венозной крови при соблюдении следующих правил:

  • Взрослые и дети в возрасте 10 лет и старше: одна пробирка 8 мл или две пробирки по 4 мл
  • Дети в возрасте 2-9 лет: одна пробирка 4 мл
  • Дети в возрасте до 2 лет: одна пробирка 2 мл

Образцы крови забирают у пациентов в пробирки для забора крови (Vacutainer® СРТ™ ) или в «пробирки с цитратом» или другие пробирки согласно рекомендациям представленным выше. Образцы хранят при температуре от 18 до 25 °С не более 8 ч, не охлаждают и не замораживают.

При использовании пробирок Vacutainer® СРТ™, пробирки с объемом 8 мл центрифугируют при 1600g в течение 28 мин, пробирки с объем 4 мл — при 1800g в течение ЗО мин при температуре от 18 до 25 °С.

При использовании других видов пробирок для забора крови перед центрифугированием необходимо предварительное разведение крови. Для этого в пробирку вместимостью 15 мл помещают 5 мл питательной среды RPMI 1640 и 5 мл крови. Перемешивают однократным переворачиванием.

Затем в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл помещают 5 мл среды для выделения МНПК (Фиколл) и осторожно наслаивают разведенную кровь. Центрифугируют при 1000g (2200 об/мин) при температуре от 18 до 25 °С в течение 22 мин.

С помощью пипетки отбирают белый мутный слой МНПК и переносят в конические центрифужные пробирки вместимостью 15 мл. Доводят объем с помощью питательной среды RPMI 1640 до 10 мл.

Центрифугируют при 600g (1700 об/мин) в течение 7 мин. Затем удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл питательной среды RPMI 1640.

Доводят объем до 10 мл питательной средой RPMI 1640 и центрифугируют при 350g (1300 об/мин) в течение 7 мин.

Сливают супернатант и ресуспендируют осадок в 0,7 мл бессывороточной питательной среды AIM-V или среды 199.

Подсчет клеток и разведение

Для анализа одного образца необходимо в каждую лунку внести по 2.5×105 МНПК. Использование недостаточного или избыточного количества клеток может привести к неправильной интерпретации результатов.

Перед отбором клеточной суспензии для анализа, разведения или подсчета клеточную суспензию следует аккуратно перемешать. В противном случае клетки могут осесть на дно пробирки, что приводит к неправильному подсчету клеток. При использовании счетной камеры, действуют в соответствии с инструкцией по применению для камеры. При использовании автоматизированного гематологического анализатора для диагностического тестирования цельной крови in vitro (COBAS MICROS ОТ) для расчета используют следующую формулу:

2,5

——— * 500 = Y, где

X — количество лейкоцитов, полученное на анализаторе

Y — количество клеточной суспензии, которую необходимо отобрать из пробирки, мкл.

Готовят 500 мкл конечной клеточной суспензии с концентрацией 2.5×10 клеток /100 мкл, для каждого исследуемого образца, используя формулу

Z = 500 — Y , где

Z — количество питательной среды, мкл Например:

При анализе получено значение содержания лейкоцитов Х= 7,0 х 103/мм3,

2,5

Y= ————- * 500 = 180 мкл

7,0

Z = 500 мкл -180 мкл =320 мкл.

Соответственно, необходимо отобрать 180 мкл клеточной суспензии и добавить 320 мкл питательной среды AIM-V.

Необходимо приготовить 500 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2.5×105 клеток /100 мкл

Подготовка планшета и инкубация

Извлекают из упаковки необходимое количество 8-луночных стрипов, закрепляют в рамке и оставляют при комнатной температуре не менее, чем на 30 мин. Оставшиеся стрипы следует убрать в холодильник. Рамки, подложки и крышки следует сохранять и использовать повторно.

Образцы на планшете рекомендуется располагать вертикально, как показано на рисунке ниже.

В лунки нулевого контроля, соответствующие буквам А и Е на планшете, добавляют по 50 мкл бессывороточной питательной среды AIM-V или среды 199.

В лунки антигена А, соответствующие буквам В и F на планшете, добавляют по 50 мкл раствора антигена А.

В лунки антигена В, соответствующие буквам С и J на планшете, добавляют по 50 мкл раствора антигена В.

В лунки положительного контрольного образца, соответствующие буквам D и Н на планшете, добавляют по 50 мкл раствора положительного контрольного образца.

Не следует касаться мембраны наконечником пипетки, т.к. это ведет к образованию вмятин, что может привести к получению ложных результатов в лунках.

Чтобы мембраны в основании каждой лунки были покрыты раствором, требуется слегка постучать по планшету. Однако интенсивного перемешивания следует избегать, с тем, чтобы избежать или минимизировать попадание антигена в соседние лунки.

Используя новый наконечник, в каждую из четырех лунок, предназначенных для одного образца крови, добавляют по 100 мкл конечной клеточной суспензии, приготовленной как указано выше. Перед очередным забором клеточной суспензии ее перемешивают путем осторожного однократного пипетирования.

Планшет инкубируют в инкубаторе с влажной камерой при 37 °С в атмосфере 5 % С02 в течение 16-20 ч. Следует избегать встряхивания планшета. Несоблюдение рекомендованного времени инкубации может привести к получению неправильных результатов.

Образование спотов (пятен) и подсчет

Извлекают планшет из инкубатора и удаляют клеточную среду путем переворачивания планшета.

Промывают каждую лунку с помощью пипетки 4 раза, добавляя по 200 мкл ФСБ. Удаляют раствор ФСБ путем переворачивания планшета на фильтровальную бумагу.

Для получения рабочего раствора конъюгированного реагента разводят концентрированный раствор в 200 раз с помощью ФСБ, который не должен содержать полисорбат 80 или другие детергенты, поскольку они повышают фоновый уровень.

Следует приготовить количество рабочего раствора, немного превышающее необходимое (на случай непроизводственных потерь). Например, на 8-луночный стрип (на каждую лунку требуется 50 мкл), рекомендуется приготовить 500 мкл рабочего раствора, добавив 2,05 мкл концентрированного конъюгированного реагента к 497,5 мкл ФСБ.

Добавляют 50 мкл рабочего раствора конъюгированного реагента в каждую лунку и инкубируют при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 ч.

Удаляют конъюгат и четырежды промывают планшет раствором ФСБ как описано выше.

Не менее чем за 30 мин до начала исследования раствор субстрата доводят до температуры от 15 до 25 °С. В каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора субстрата, и инкубируют планшет в течение 7 мин при комнатной температуре.

Чтобы остановить реакцию тщательно промывают планшет дистиллированной водой.

Помещают планшет на 4 ч в термостат с температурой 37 °С или оставляют в течение ночи при комнатной температуре.

Подсчитывают и записывают количество отчетливо видных темно­синих пятен на мембране каждой лунки.

Для определения «ТБ-положительного» или «ТБ-отрицательного» результата на наличие туберкулезной инфекции образца крови пациента к ТБ антигенам используют критерии интерпретации результатов исследования/

Интерпретация результатов исследования

Перед применением нижеприведенных критериев, обратитесь к разделу контроля качества постановки теста.

Критерии:

В лунке с положительным контрольным образом должно быть 20 или более пятен.

В лунках нулевого контроля пятна, как правило, должны отсутствовать.

При оценке результатов следует учитывать, что в нулевом контроле допускается наличие пятен, при этом:

а) Если в нулевом контроле содержится от 1 до 5 пятен, то для определения количества пятен в лунках с антигенами, необходимо вычесть из числа пятен в лунке с антигеном А и с антигеном В число пятен в нулевом контроле.

б) Если в нулевом контроле содержится от 6 до 10 пятен, то для определения количества пятен в лунках с антигенами необходимо вычесть из числа пятен в лунке с антигеном А и с антигеном В, двукратное число пятен в нулевом контроле.

Нулевой контроль в котором наблюдается более 10 пятен должен рассматриваться как «сомнительный». Подобный результат трудно интерпретировать. Необходимо повторить исследование.

ТБ-отрицательный результат:

В результате анализа (см. п. Критерии) количество пятен в лунке антигена Айв лунке антигена В должно быть не более 5 с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б).

ТБ-положительный результат:

В результате анализа количество пятен в лунке с антигеном Айв лунке с антигеном В должно быть от 8 до 100 с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б). Если пятен много, то их число можно не подсчитывать, указав в протоколе, что их более 20. Так как растворы антигена А и антигена В имеют разный состав, то образцы крови больных туберкулезом могут реагировать как на один из антигенов, так и на оба антигена.

Серая зона

При проведении исследования может иметь место серая зона включающая 5-7 пятен в лунках с антигеном А или В (с учетом числа пятен в нулевом контроле (см. п. Критерии, а) и б). В таком случае необходимо повторить исследование.

Контроль качества постановки теста

Типичным ожидаемым результатом является следующий: отсутствие или несколько пятен в нулевом контроле и более 20 пятен в положительном контроле.

Нулевой контроль, в котором наблюдается более 10 пятен, должен рассматриваться как «сомнительный». Подобный результат трудно интерпретировать. О его возможных причинах можно справиться в Техническом руководстве Т-СПОТ.ТБ (T-SPOT®.TB) (См. приложении к данной инструкции или английскую версию на сайте www. oxfordimmunotec. com). У такого пациента необходимо повторно забрать кровь и сделать повторное исследование.

Обычно в положительном контроле функционального состояния клеток наблюдается количество пятен > 20 или перенасыщение (слишком много пятен, чтобы их сосчитать). У небольшого процента пациентов могут быть Т клетки, которые демонстрируют лишь

13, 1

ограниченный ответ на ФГА . Если количество пятен в положительном контроле < 20, он должен рассматриваться как «сомнительный», но только в тех случаях, когда в результате оценки (с учетом отрицательного контроля) пятен в лунках с антигеном А или антигеном В (см. ниже) ответ будет признан отрицательным. Если же количество пятен в лунках с антигеном А и/или с антигеном В показывает что образец крови ТБ-положительный, то результат исследования следует учитывать как положительный.

«ТБ-положительный результат» свидетельствует, что образец содержит эффекторные Т клетки реактивные (специфически сенсибилизированные) к М. tuberculosis.

«ТБ-отрицательный результат» свидетельствует, что образец вероятно не содержит эффекторных Т клеток, реактивных (специфически сенсибилизированных) к М. tuberculosis.

Транспортирование и хранение

Транспортировать всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8 °С, допускается транспортирование при температуре от 15 до 25 °С не более 5 сут. Не замораживать.

Хранить при температуре от 2 до 8 °С. Не замораживать.

Срок годности набора — 12 месяцев

Срок годности

12 месяцев. После вскрытия упаковки набор можно хранить не более 8 нед. Не использовать набор после истечения срока годности указанного на упаковке.

Упаковка

  1. Микротитровальный планшет герметично упакован в пакет из алюминиевой фольги.
  2. Антиген А в стеклянном флаконе вместимостью 3 мл с герметично завинчивающейся пластиковой крышкой по 0,8 мл, 2 шт.
  3. Антиген В в стеклянном флаконе вместимостью 3 мл с герметично завинчивающейся пластиковой крышкой по 0,8 мл, 2 шт.
  4. Положительный контрольный образец в стеклянном флаконе вместимостью 3 мл с герметично завинчивающейся пластиковой крышкой по 0,8 мл, 2 шт.
  5. Конъюгированный реагент в полимерной пластиковой пробирке типа Эппендорф с пластиковой крышкой по 50 мкл, 1 шт.
  6. Раствор субстрата в пластиковом флаконе коричневого цвета вместимостью 30 мл с герметично завинчивающейся пластиковой крышкой (фирма Mabtech кат.№ 3650-2) по 25 мл, 1 шт.

Флаконы с реагентами в пенопластовом вкладыше. Микротитровальный планшет, вкладыш с флаконами, инструкция по применению на бумажном и/или электронном носителе в пачке картонной. На электронном носителе на русском и английском языках также записаны: техническое руководство, визуальное руководство, калькуляторы для расчета скорости центрифуги, разведения клеток и раствора субстрата.

Список литературы:

1 Janeway and Travers (1996) Immunobiology 2nd Ed.

2 Staines et al (1999) Introducing Immunology 2nd Ed.

3. Chapman et al (2002) AIDS, 16 (17): 2285-2293.

4 Ewer et al (2003) Lancet, 361: 1168-1173.

5. See www.elispot-analyzers.de/english/science-elispot-assays.html

6 Pathan et al (2001) J. Immunol., 167: 5217-5225.

7 Lalvani et al (2001) Lancet, 357: 2017-2021.

8 Lalvani et al (2001) Am. J. Resp. Crit. Care Med., 163: 824-828.

9 Lalvani etal (2001) J. Infect. Dis., 183: 469-477.

10 Meier et al (2005) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 24: 529-536.

11 Zellweger et al (2005) Int. J. Tuberculosis and Lung Dis., 9(11): 1242- 1247.

12 NCCLS Approved Guideline. Performance of single Cell Immune Response Assays, I/LA26-A

13 Koller et al (2003) Clin. Exp. Immunol., 132(2): 225-231.

14 Apollonj et al (1975) Immunol. Commum., 4(5): 453-463

Объяснение символов на внутренней и внешней упаковке

Дополнительные характеристики.

См. приложении к данной инструкции или английскую версию в наборах предназначенных для СЕ маркирования.

T-SPOT® и логотип Оксфорд Иммунотек являются торговыми марками компании «Оксфорд Иммунотек Лимитед».

T-SPOT.TB — ЭТО НЕ ПРОСТО АЛЬТЕРНАТИВА КОЖНЫМ ТЕСТАМ НА ТУБЕРКУЛЕЗ.
Т-SPOT.TB — ЭТО ИННОВАЦИОННАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ПО АНАЛИЗУ КРОВИ, КОТОРАЯ ОБЛАДАЕТ РЯДОМ ПРЕИМУЩЕСТВ:

• Чувствительность обнаружения туберкулеза превышает 95% и приближается к 100%.
• Высокоспецифичность, почти до 100%. В отличие от реакции Манту, специфичность которой составляет около 40%, исключает ложный положительный диагноз на туберкулез в связи с отсутствием перекрестной реактивности с другими, нетуберкулезными бактериями.
• Вакцины от различных болезней, в том числе БЦЖ, никак не влияют на результат теста T-SPOT.TB.
• В отличие от реакции Манту, нет необходимости вторично посещать лабораторию для получения оценки кожной реакции, вся процедура выполняется за один визит.
• Организм не подвергается рискам введения чужеродных белков и аллергенов, которые сопровождают инъекцию при кожном тесте.
• Тест T-SPOT.TB свободен от погрешностей, сопровождающих кожный тест, — неполного или неправильного введения препарата.
• Также нет риска потери туберкулином необходимых свойств из-за неправильного хранения.
• Проба Манту имеет «бустерный эффект» — при несоблюдении сроков интервалов между проверками ее реакция усиливается. Тест T-SPOT.TB таких ограничений не имеет.
• Нет противопоказаний, имеющихся у кожных проб, которые нельзя проводить при кожных заболеваниях, аллергиях, эпилепсии и многих других болезнях.
• T-SPOT.TB лишен таких побочных реакций как головная боль или повышение температуры, часто сопровождающих кожные тесты.
• Результат тестирования выдается в кратчайшие сроки.

В ЧЕМ СУТЬ МЕТОДИКИ ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА T-SPOT.TB
Тестирование T-SPOT.TB проводится вне организма человека. Такое тестирование еще называют «in vitro» («в пробирке»). При этом выявляется процесс продуцирования гамма-интерферонов Т-лимфоцитами при его встрече с белками ESAT-6 и CFP-10 микобактерий туберкулеза. Наличие заболевания выявляется по числу Т-клеток, реагирующих на присутствие соответствующих туберкулезной палочке антигенов. Это позволяет отделить реальное заболевание от вакцины или других бактерий — соответствующих белков у них нет. Если же человек заражен микобактериями M.tuberculesis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canetti — Т-клетки у него присутствуют.

О НАЗВАНИИ T-SPOT.TB
• «T»: T-лимфоциты, наличие которых и определяет результат исследования.
• «SPOT» (англ. «пятно»). Т-лимфоциты в лунках маркируются пятнами, получающимися во время тестирования.
• Буквами «TB» на международном уровне сокращенно обозначают туберкулез.
ТАК ВЫГЛЯДИТ РЕЗУЛЬТАТ ТЕСТА Т-SPOT.TB В ЛАБОРАТОРИИ

Столбик лунок слева — результат отрицательный, туберкулеза нет. Столбик лунок справа — туберкулез выявлен.
Независимо от приема пищи, никакой специальной подготовки не требуется!
Анализ T-SPOT.TB применяется в европейских странах, Канаде, также его использование одобрено в США.
Согласно закону ФЗ — 2012/648, принятому в 2012 году, тестирование по методике T-SPOT.TB одобрено и в России.

Нет Ответов

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *